分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶， 能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。  測(cè)定原理：

PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在 525nm 有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體，60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體，40mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體，10mL×1 瓶，4℃保存； 粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1mL血清（漿）或果汁加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴 10min 后，95℃水浴 5min

充分混勻，10000g，25℃離心 10min，取上清，525nm 處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度。ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。

注意：煮沸樣本的操作：取 300μL 離心上清于 EP 管中，進(jìn)行 5min 95℃水浴處理；每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行 5min

95℃水浴處理。

PPO 活性計(jì)算：

1、血清（漿）或果汁 PPO 活性

單位的定義：每分鐘每 mL 血清（漿）或果汁在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化

0.01 為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V 液

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.08mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL；V 樣：加入樣本體積，0.18mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。