主要用途

真菌/細胞β-半乳糖苷酶活性高質敏感比色法定量檢測試劑是一種旨在使用化學和物理方法，快速有效地裂解真菌細胞，通過高速離心，獲得澄清細胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應體系里，以氯苯胺紅 -β-D- 吡喃半乳糖苷為棕黃色底物，水解所產(chǎn)生的暗紅色的氯苯胺紅，即采用比色法定量測定細胞裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此建立一種簡單的定量評價報告基因的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。其適用于轉基因后的真菌/酵母活體細胞分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡便、比色敏感，堪稱國際上同類產(chǎn)品*佳。

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）      10毫升

強化液（Reagent B）     2毫升

活性液（Reagent C）   250微升

稀釋液（Reagent D）    10毫升

反應液（Reagent E）     2毫升

終止液（Reagent F）    10毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent C）和反應液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于真菌/酵母細胞收集的容器

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母細胞裂解操作或染色的容器

臺式離心機：用于沉淀真菌/酵母細胞

微型臺式離心機：用于真菌/酵母細胞裂解懸液澄清

比色皿或96孔板：用于染色后比色檢測的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應物孵育

計時器：用于反應計時

分光光度儀或酶標儀：用于測定反應物的吸光值

實驗步驟

實驗開始前，開啟分光光度儀預熱，設置波長420nm；開啟恒溫水槽，設置溫度為28℃。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent C）和反應液（Reagent E）置于冰槽里融化；反應液（Reagent E）避免光照。然后進行下列操作：

一、 樣品準備

1． 準備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）

2． 移入到預冷的15毫升錐形離心管

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

8． 加入100微升強化液（Reagent B）

9． 加入12.5微升活性液（Reagent C）

10． 強力渦旋震蕩15秒

11． 置于冰槽里1分鐘

12． 重復實驗步驟10至11五次

13． 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻

14． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 活性檢測

方法一：常規(guī)檢測（比色皿）

1． 移取100微升上述制備的細胞裂解懸液樣品到新的比色皿

2． 加入500微升稀釋液（Reagent D）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 放進37℃恒溫水槽孵育5分鐘

5． 加入100微升反應液（Reagent E）（注意：使用前，充分混勻反應液（Reagent E）中可能的沉淀） 

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻

7． 放進37℃恒溫水槽孵育至少30分鐘，直至出現(xiàn)暗紅色（注意：參見注意事項11和12）

8． 加入300微升終止液（Reagent F）

9． 即刻放入分光光度儀檢測，記錄樣品吸光讀數(shù)，理想讀數(shù)為0.1至1.2范圍內(nèi)

一、 計算樣品活性

計算一：按照操作步驟規(guī)定

1． 比色皿計算：

[樣品讀數(shù) X 1.0（反應體積，毫升）]÷[0.1（樣品容量，毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 反應時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

2．96孔板計算：

  [樣品讀數(shù) X 0.25（反應體積，毫升）]÷[0.02（樣品容量，毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（厘米）X反應時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

計算二：基本公式

[樣品讀數(shù)X樣品稀釋倍數(shù) X反應體積（毫升）]÷[樣品容量（毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 比色距徑（厘米）X反應時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

計算三：（微摩爾CPRG/分鐘/毫升）換算成（微摩爾CPRG/分鐘/毫克樣品蛋白）

[實際活性值（微摩爾CPRG/分鐘/毫升）]÷實際樣品蛋白濃度（毫克/毫升）＝微摩爾CPRG/分鐘/毫克樣品蛋白

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作

2． 建議使用核內(nèi)表達的載體代替胞內(nèi)表達的載體轉染或感染細胞

3． 本產(chǎn)品的各項參數(shù)達到化

4． 建議操作時，注意避光

5． 操作時，須戴手套

6． 強化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1克

7． 反應液（Reagent E）避免光照和反復凍融

8． 用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需；建議使用－Bradford蛋白質濃度定量檢測試劑盒（GMS30030.1）

9． 如果用戶需要測定背景空對照，可以按照活性檢測的操作步驟進行，變化在于100微升樣品改成100微升裂解液（Reagent A）替代

10． 如果用戶測得背景空對照，計算活性時，勿忘（樣品吸光讀數(shù)－背景空對照讀數(shù)）

11． 反應孵育時間的理想范圍為10分鐘至30分鐘內(nèi)出現(xiàn)暗紅色顯色：低于5分鐘表明酶活性過高，建議稀釋樣品，否則影響檢測精度 

12． 如果樣品的酶活性過低，可以增加孵育時間至72小時

13． 樣品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD單位為理想狀態(tài)，其酶活性與吸光值成線性正相關；吸光值在0.3至0.9 OD單位為狀態(tài)

14． 反應終止后，即刻進行比色測定

15． 比色測定后，比色皿須清洗

16． 酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的氯苯胺紅 -β-D- 吡喃半乳糖苷

17． 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產(chǎn)品