間接ELISA法篩選陽性雜交瘤及測定單抗清河常數(shù)

   酶聯(lián)免疫吸附測定法，簡稱ELISA（enzyme-linkde innunosorbent assay），是把特異性的抗原抗體結合反應與酶促反應相結合，zui后以酶促反應的放大作用來顯示zui初的免疫反應，它既能用于抗原的測定又可用于抗體的測定。間接ELISA法及時能測定抗體的一種ELISA方法，現(xiàn)將可溶性抗原或細菌細胞包被于聚苯乙烯酶標板上，然后加入待測抗體液，在加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗鼠抗體，zui后加入HRP底物，依據(jù)顯色反應的程度來判斷抗體的有無及活性的高低。間接ELISA具有敏感性高，可檢測抗體濃度在ug-ng/ml水平，重復性好，快速簡便等優(yōu)點，是篩選陽性雜交瘤及測定單抗親和常數(shù)的常用方法。

材料與方法

間接ELISA篩選陽性雜交瘤

1、抗原包被 如是可溶性抗原、根據(jù)其面議原性用碳酸鹽緩沖液（0.01mol/L Na2CO30.01mol/L NaHCO3， PH9.6)溶解成0.1-20ug/ml，然后以每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯酶標板中，4℃guo夜。

如是細胞抗原，則將對生長期每孔含10個細胞加入酶標板，37℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)24-48小時，令細胞場面貼壁后，棄培養(yǎng)液，已含0.05%Tween-20的PBST液洗1次，加入0.05%戊二醇0.1ml，4℃置5分鐘，然后以PBST洗3次，每次3分鐘。

2 封閉 PBST洗包被板1次，每孔加0.1ml0.1%牛許晴血蛋白液（溶于PBS），4℃guo夜已封閉非特異性位點。

3 一抗溫育 將封閉好的酶標板以PBST洗1次，無菌下取融合細菌孔發(fā)黃的待測培養(yǎng)液加入酶標板，每孔0.1ml，一個待測樣品設兩個檢測孔。用無菌細胞生長孔培養(yǎng)液做陰性對照，如有陽性抗體對照也應設置陽性對照。37℃溫育1小時。

4 酶標二抗溫育 棄去待測上清，PBST洗3次，每次3分鐘。加入用PBS液稀釋成使用濃度的HRP標記的羊抗小鼠Ig抗體，37℃溫育1小時。

5 洗滌 棄去酶標二抗，PBST洗6次，每次3分鐘。大鼠ELISA試劑盒

6 顯色反應 避光下，先用現(xiàn)配鄰苯二胺（OPD）底物反應液，40mgOPD榮譽100mlPH5.0檸檬酸緩沖液中（含檸檬酸·H2O 2.10g,Na2HPO4·12H2O 7.61g），并加入30%H2O2150ul，然后每孔0.1ml加入酶標板，觀察顯色反應狀況，一般10分鐘左右即可每孔加入2mol/LH2SO4 0.1ml 以終止顯色反應。

7 結果判定 在酶標測定儀上一掃描波長492nm測量各孔吸光值，以待測孔吸光值高于陰性對照空0.5（可溶性抗原）或0.2（細胞抗原）為陽性結果。

間接ELISA法測定單抗親和常數(shù)

1 實驗操作流程基本上上訴實驗相似。

2 根據(jù)預實驗經(jīng)驗，選擇3個城北比稀釋的抗原濃度包被96孔酶標板，如可溶線抗原可選擇1ug/孔，0.5ug/孔，0.25ug/孔包被，細胞抗原可選擇2x，1x，0.5x。

3 大策純化抗體的起始濃度為1mg/ml左右，以1:50,1:100，1:400,1:800,1:1600,1：:3200,1:6400,1:12800稀釋度加入酶標板，且每個稀釋度至少應設置2個測定空。

4 根據(jù)酶標儀測定結果，扣除陰性對照值，然后以吸光值縱坐標，以抗體稀釋度的對數(shù)為橫坐標作劑量反應曲線，計算每個抗原包被濃度下zui大吸光值一半時對所對應的抗體濃度。即抗體的相對親和力

5 根據(jù)公式計算前和常熟Ka Ka=(n-1）/2（nAb-Ab)。其中Ab,Ab分別為包被抗原濃度為Ag,Ag時，zui大吸光值一半時所對應的抗體濃度。N=Ag/Ag,n一般取2即可，zui后常數(shù)表示Ka=X±1.96SE.

注意事項

1間接ELISA篩選陽性孔融合細胞，陽性結果應至少重復兩次才比較可靠，否則容易出現(xiàn)假陽性結果。

2 測定親和常數(shù)時，抗原的包被濃度要選擇適當，每步要充分封閉，充分溫育，充分洗滌，以防記過出現(xiàn)偏差。

3 間接ELISA法一定要設置陰性對照，如有陽性對照，也應設置，以供參考。